Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small cell lung cancer
四川大学华西医院胸部肿瘤科卢铀教授团队联合多家公司机构以及和瑞基因近日取得一项新成果,他们利用CRISPR-Cas9敲除了T细胞的PD-1基因,然后体外扩增后回输患者体内用于治疗经多线治疗失败的非小细胞肺癌患者。该项I期临床试验入组12名非小细胞肺癌患者,评估了CRISPR-Cas9编辑T细胞的安全性和可行性。该里程碑性工作标志着基因编辑在癌症精准诊疗的临床应用中迈出重要一步。这项重要研究结果日前以article的形式在线发表在Nature Medicine杂志上(IF=30.6)。
PD-1又称为程序性死亡受体1,是一种重要的免疫抑制分子,其一旦与肿瘤细胞上的配体PD-L1结合,就会阻断T细胞对肿瘤细胞的杀伤。研究人员通过采集受试者的外周血,利用CRISPR-Cas9技术敲除患者T细胞中的 PD-1基因,然后扩增这些基因编辑过的细胞,再将它们回输到患者体内。所有治疗相关的副反应为1-2级。
CRISPR能帮助研究人员快速有效地对基因组进行有针对性的切割,它的特异性和易用性使其成为了颇具潜力的工具。然而,该技术却存在着脱靶风险——不仅切割目标位点,在具有相似序列的非预期位置上也可能会发生切割。这些脱靶切割可能发生在整个基因组中,带来大量非靶序列的SNVs和InDels,导致产生损害细胞功能或直接杀死细胞的有害突变,这将大大限制CRISPR的临床应用。在临床转化中,使用能准确寻找脱靶位点的方法有重要意义。
在本研究中,研究人员首先基于gRNA序列,利用sgRNAcas9预测出了18个可能的脱靶位点(off-target)。针对这18个off-target区,和瑞基因设计了36对背靠背式的引物,使用专利的cSMART(环化单分子扩增和重测序技术)技术对这12个患者的编辑细胞样本进行了高深度靶向测序(20,000 x),检查这些预测的脱靶位点突变。结果显示off-target位点的突变频率较低(中位突变频率为0.05%(0-0.25%)。且绝大部分脱靶突变位于基因间区(48.1%)和内含子区(35.1%),这些区域对编码基因不会造成显著影响。即利用高灵敏度cSMART技术成功证实,本研究中基因编辑的安全性和可行性并未受到编辑脱靶效应的影响。
然而通过计算机模拟预测gRNA脱靶位点存在一定的局限性,卢铀教授团队在和瑞基因公司合作下又采用全基因组测序评估脱靶效应。该方法能全方位精准地对基因编辑的细胞进行off-target检测,尤其是对于未知突变的检测将更为准确。研究人员利用Cas-OFFinder软件在全基因组范围内预测出了2086个off-target位点,而WGS分析发现这2086个off-target区(± 15 bp),并未发生Indel事件。然后我们又将区间扩展至off-target位点上下游200 bp内,发现在其中的53个位点处检测到了84个Indel,而这些Indel全都出现在repeat区,不是真正的脱靶位点。
Figure 3: Off-target analysis by next generation sequencing (NGS) and whole genome sequencing (WGS).
在这项研究中,和瑞基因通过cSMART专利技术实现了超低频检测,并从深度(20,000x)和广度(WGS,100x)两个维度针对CRIPSR脱靶事件进行了全面检测与评估,从分子层面上初步证实CRISPR-Cas9编辑T细胞的安全性和可行性,在NSCLC免疫治疗创新性探索中迈出重要一步。
